一.目的

对实验室的标准菌株进行合理的(de)操(cao)作，确(que)保菌株(zhu)的长(zhang)久(jiu)使用和性能的(de)稳定。

二(er).传(chuan)代实验(yan)

1.将在(zai)室温放(fang)置30分钟的菌种斜(xie)面管移入超净工作台中。

2.点(dian)燃酒精(jing)灯(deng)，先用左手将菌种管(guan)的试管(guan)口斜向上靠(kao)近火焰(yan)，缓慢旋(xuan)转(zhuan)加热灭菌。用右手在(zai)(zai)火焰(yan)旁(pang)轻轻转(zhuan)动橡胶塞，以便易拔取，再用右手持接种环在(zai)(zai)火焰(yan)上烧红30秒，随后将全部(bu)铂金丝及金属棒(bang)部(bu)分在(zai)(zai)火焰(yan)上灼烧，往返通过3次。

3.在(zai)(zai)火焰(yan)旁，用右手的无(wu)(wu)名(ming)指、小(xiao)指及手掌(zhang)部夹住(zhu)橡胶(jiao)塞，轻轻拔出橡胶(jiao)塞，并勿(wu)使其(qi)与任何物(wu)品接触(chu)。将灼烧(shao)过的接种(zhong)环伸入菌(jun)(jun)种(zhong)管(guan)内(nei)，先接触(chu)无(wu)(wu)菌(jun)(jun)生长的培养(yang)基，待冷(leng)后，从(cong)斜面上挑取少量(liang)菌(jun)(jun)苔(tai)，取出时，接种(zhong)环放(fang)置在(zai)(zai)火焰(yan)旁。左手的菌(jun)(jun)种(zhong)管(guan)口旋转地在(zai)(zai)火焰(yan)上受(shou)热(re)灭菌(jun)(jun)，右手无(wu)(wu)名(ming)指、小(xiao)指及手掌(zhang)部夹住(zhu)的橡胶(jiao)塞快速(su)地来(lai)回通(tong)过火焰(yan)，并迅(xun)速(su)塞回菌(jun)(jun)种(zhong)管(guan)上。再(zai)将菌(jun)(jun)种(zhong)管(guan)的管(guan)口处在(zai)(zai)火焰(yan)上灭菌(jun)(jun)。

4.同(tong)样的操(cao)作，将接(jie)种(zhong)(zhong)(zhong)管的橡胶(jiao)塞(sai)拔出，把粘有菌种(zhong)(zhong)(zhong)的接(jie)种(zhong)(zhong)(zhong)环轻贴斜(xie)面的表面，由下到(dao)上(shang)(shang)曲折移动，使(shi)菌种(zhong)(zhong)(zhong)划(hua)在斜(xie)面的表面上(shang)(shang)，注(zhu)意只划(hua)动一次(ci)，勿重复移动，且勿使(shi)菌苔沾在管壁口(kou)。再用同(tong)样的操(cao)作将橡胶(jiao)塞(sai)塞(sai)回接(jie)种(zhong)(zhong)(zhong)管，然(ran)后将接(jie)种(zhong)(zhong)(zhong)管的管口(kou)处(chu)在火(huo)(huo)焰上(shang)(shang)灭菌。接(jie)种(zhong)(zhong)(zhong)过的接(jie)种(zhong)(zhong)(zhong)环在火(huo)(huo)焰上(shang)(shang)灼烧灭菌。

已接(jie)种完毕的各管贴好(hao)标签，注明菌名、编号、代(dai)次（n+1）和(he)传代日(ri)期、操作人、有效(xiao)期，同时填好(hao)《菌种(zhong)使用记录表(biao)》。

5.按规定的温度和时间培养。

6.培养(yang)到期(qi)后取(qu)出培养(yang)物(wu)，仔细(xi)观察菌苔形状，是否(fou)正常，并(bing)与上代(dai)菌种比较，有无(wu)杂菌。必要时涂片，革(ge)兰氏(shi)染色镜(jing)检。

检(jian)查合(he)格的(de)菌种，放(fang)入冰(bing)箱内2-8℃保存，一(yi)(yi)(yi)般(ban)一(yi)(yi)(yi)个月(yue)(yue)转钟一(yi)(yi)(yi)次。一(yi)(yi)(yi)般(ban)情况(kuang)：当工(gong)作(zuo)(zuo)(zuo)菌(jun)(jun)(jun)株小(xiao)于5代(dai)时可(ke)直接用(yong)(yong)(yong)上(shang)一(yi)(yi)(yi)代(dai)工(gong)作(zuo)(zuo)(zuo)用(yong)(yong)(yong)菌(jun)(jun)(jun)种接种下一(yi)(yi)(yi)代(dai)工(gong)作(zuo)(zuo)(zuo)用(yong)(yong)(yong)菌(jun)(jun)(jun)种，作(zuo)(zuo)(zuo)为(wei)工(gong)作(zuo)(zuo)(zuo)用(yong)(yong)(yong)菌(jun)(jun)(jun)种。也(ye)可(ke)选用(yong)(yong)(yong)保存的菌(jun)(jun)(jun)种进(jin)行(xing)复苏，直接作(zuo)(zuo)(zuo)为(wei)工(gong)作(zuo)(zuo)(zuo)用(yong)(yong)(yong)菌(jun)(jun)(jun)种。细菌(jun)(jun)(jun)每1个月(yue)(yue)传(chuan)(chuan)代(dai)一(yi)(yi)(yi)次，酵母菌(jun)(jun)(jun)每2个月(yue)(yue)传(chuan)(chuan)代(dai)一(yi)(yi)(yi)次，霉菌(jun)(jun)(jun)及芽孢每3个月(yue)(yue)传(chuan)(chuan)代(dai)一(yi)(yi)(yi)次。当超过5代(dai)，需用(yong)(yong)(yong)传(chuan)(chuan)代(dai)用(yong)(yong)(yong)菌(jun)(jun)(jun)种传(chuan)(chuan)代(dai)。传(chuan)(chuan)代(dai)时应无菌(jun)(jun)(jun)操作(zuo)(zuo)(zuo)，使菌(jun)(jun)(jun)株不(bu)死亡、不(bu)污染、不(bu)丢失(shi)。实(shi)验(yan)人员应采(cai)取有效的预防措施进(jin)行(xing)自我保护(hu)，穿好工(gong)作(zuo)(zuo)(zuo)服，佩(pei)戴无菌(jun)(jun)(jun)手套，实(shi)验(yan)完成(cheng)后对实(shi)验(yan)区域、实(shi)验(yan)仪(yi)器和(he)器具进(jin)行(xing)消毒。

菌株编号：传代用菌种可用字(zi)母“G”表示(shi)，工作(zuo)(zuo)用(yong)菌(jun)种可(ke)用(yong)字母(mu)“W”表示(shi)。菌(jun)种的英(ying)文缩写：大肠(chang)埃希(xi)氏菌(jun)（E.c），金(jin)黄(huang)色葡萄球菌(jun)（S.a），白色念珠(zhu)菌(jun)（C.a）等等。传(chuan)(chuan)(chuan)代(dai)日期用(yong)6位(wei)数字表示(shi)，年份取最后两(liang)位(wei)数，如2021年06月21日传(chuan)(chuan)(chuan)代(dai)的第一支大肠(chang)埃希(xi)氏菌(jun)作(zuo)(zuo)为传(chuan)(chuan)(chuan)代(dai)用(yong)菌(jun)种的编号为:E.c-G3-210624-01。

三.保存方(fang)法(fa)

1.斜面低温(wen)保(bao)藏法

1.1操作方(fang)法(fa)

无菌(jun)条件下(xia)，将待(dai)保存的菌(jun)株(zhu)菌(jun)落或(huo)悬(xuan)浊液，以无菌操作接种在适宜的固体斜面(mian)培(pei)养基(ji)上(shang)，按规定的温度和(he)时间培(pei)养，待充分生长后，把培养好(hao)的新鲜的菌种的橡胶塞部分用牛皮纸包扎好，移(yi)至2-8℃的冰箱中低温保藏(zang)，保藏(zang)时间依(yi)微生物的种类不同(tong)而确(que)定。定期(qi)对保存的菌(jun)株(zhu)进行转种，转种频率(lv)为(wei)一月一次(ci)。

1.2 注意事项

①必须定期检查(cha)保藏菌种(zhong)冰箱温(wen)度和(he)菌种(zhong)管(guan)的橡胶(jiao)塞是(shi)否松动或生(sheng)霉(mei)，如有异常(chang)应及时处理。

②每次移植后(hou)，应(ying)与原菌(jun)种的编号(hao)、名称逐一核对，确(que)保培养基(ji)特征和纯度无误后(hou)在继续保藏(zang)。

2.瓷珠菌种保管(guan)法

2.1 操(cao)作(zuo)方(fang)法

在(zai)无菌条件(jian)下，用浸过(guo)75%酒精的(de)脱脂棉擦净冻(dong)存管表面并让其自然风干，打开冻(dong)存管的(de)螺旋瓶(ping)盖(gai)，用灭菌(jun)的(de)接种环挑取(qu)待保存的菌(jun)株菌(jun)落或悬浊(zhuo)液，放(fang)入(ru)冻存液(ye)(ye)中；拧(ning)紧瓶盖，来回(hui)颠倒使菌(jun)(jun)体乳化为混浊的菌(jun)(jun)悬(xuan)(xuan)浊液(ye)(ye)，此时(shi)菌(jun)(jun)悬(xuan)(xuan)浊液(ye)(ye)会吸(xi)附在(zai)小瓷珠内外表面；用无菌(jun)(jun)移液(ye)(ye)器将冻存管(guan)中的菌(jun)(jun)悬(xuan)(xuan)浊液(ye)(ye)尽量(liang)吸(xi)出（吸(xi)出的菌(jun)(jun)悬(xuan)(xuan)浊液(ye)(ye)应放(fang)入(ru)消毒液(ye)(ye)中并随后进行高压灭菌(jun)(jun)处(chu)理）；拧(ning)紧瓶盖贴上相(xiang)(xiang)应的详细标签，并做好相(xiang)(xiang)关菌(jun)(jun)种记录，将冻存管(guan)置(zhi)于-20℃冰箱中(zhong)密(mi)封(feng)上锁保(bao)存。

3.液体(ti)石蜡保藏法(fa)

3.1 操作方法

将(jiang)液体(ti)(ti)石(shi)蜡分装于三角烧(shao)瓶内，塞上(shang)具砂芯的(de)硅胶塞，并(bing)用(yong)牛皮纸(zhi)包扎(zha)，121℃灭菌(jun)(jun)30min，然(ran)后放(fang)在40℃温箱中(zhong)，使水汽蒸发掉，备(bei)用(yong)。将菌(jun)(jun)种(zhong)穿刺接种(zhong)于(yu)半固(gu)体高层培养(yang)基中(zhong)，在适宜条件(jian)下培养(yang)结束后，用(yong)无菌(jun)(jun)吸管(guan)吸取无菌(jun)(jun)液体石蜡(la)至培养(yang)好的菌(jun)(jun)种(zhong)管(guan)内，并使石蜡(la)高出菌(jun)(jun)种(zhong)表(biao)面约1cm，使菌(jun)(jun)体与空气隔绝，并将试管(guan)直立，置(zhi)于(yu)-20℃冷冻或冷藏保(bao)存(cun)。

4.甘油冷冻保藏法

4.1 操作方(fang)法(fa)

刮取平板或(huo)琼(qiong)脂斜面的培养物(wu)，放入装有(you)无菌(jun)(jun)纯(chun)化(hua)水的试(shi)管中，通过接种环与试(shi)管壁间的摩擦(ca)，使细菌(jun)(jun)充分扩散到(dao)纯(chun)化(hua)水中，制(zhi)备成菌(jun)(jun)悬液。向已制(zhi)备好的菌(jun)(jun)悬液中加入等(deng)体积的无菌(jun)(jun)甘油（浓度20%（V/V）），即为10%（V/V）甘油(you)菌悬液，轻轻振摇，充分混合后(hou)，分装于无菌小试管或(huo)冻存(cun)管，冷冻保存(cun)。-20℃保存(cun)，一般(ban)菌株(zhu)可(ke)保存(cun)3年(nian)以上，链球菌、奈瑟菌可(ke)保存(cun)12-15个月。

（检(jian)验分析(xi)中心）